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數字PCR引領分子診斷熱潮,輸液瓶口貼推動精準醫療迅速發展!
- 2019-07-16 -

數字PCR簡介

  數字PCR(Digtal PCR)是一種核酸定量精密檢測的新興技術手段,于20世紀由Vogelstein等提出。它是將稀釋后的核酸模板分配到大量不同的反應單元中,使每個反應單元中有一個或沒有核酸。利用PCR擴增的同時,加入可檢測熒光。待擴增結束時,使用統計學方法采集每個反應單元出現的熒光次數,從而定量檢測樣本中的核酸濃度。

  基于分液方式的不同,數字PCR主要分為3種:微流體數字PCR(Microfluidic digital PCR,mdPCR)、微滴數字PCR(Droplet digital PCR,ddPCR)和芯片數字PCR(Chip digital PCR,cdPCR)。

輸液瓶口貼的優勢

  相對于二代測序、基因芯片和定量PCR而言,數字PCR具備以下優勢:

  · 靈敏度可達到單個核酸分子:檢測限低至0.001%,主要系為數字PCR可以實現靶標DNA/RNA的生物濃縮;

  · 無需標準曲線活參照基因進行對比來測定核算量,可對靶分子起始量進行絕對定量,直接獨處DNA分子的個數;

  · 適合環境復雜樣品的檢測:終點PCR檢測,不依賴Ct值,不依賴擴增效率,能克服PCR抑制劑的影響,避免樣品間的交叉感染問題,適合各類復雜環境中的樣本進行絕對定量,如動血樣、糞便、尿液、痰液、水樣、土壤、植物等;

  · 能夠有效區分濃度差異微小的樣品:更好的準確度、精密度和重復性,可以用于精確測定靶基因的相對表達,基因拷貝數變異分析等。

  · 數字PCR可開發針對不同癌癥、不同樣本以及不同的樣本環境提供檢測解決方案,該技術的應用范圍廣泛,尤其在液體活檢領域,已開發針對肺癌、乳腺癌、腸癌、胃癌等上百個位點檢測試劑盒,可精準指導臨床治療的診斷,以便患者在后續得到更及時并且適當的治療方案提供。

數字PCR輸液瓶口貼技術應用

  隨著美國FDA批準了一款用于白血病BCR-ABL融合基因檢測的數字PCR試劑盒,標志了這一技術正式走向廣闊的臨床應用市場。我國的分子診斷市場正處于快速發展階段,預計2021年可以達到100億以上的規模,而數字PCR將成為這一市場高速增長的重要驅動力。

  數字PCR技術可廣泛應用于腫瘤液體活檢、靶向治療伴隨診斷、無創產前檢測、病原微生物(病毒、細菌、真菌等)檢測、食品安全檢測、遺傳疾病診斷、移植排斥監控、腸道菌群分析、藥物基因組檢測、基因表達分析、環境檢測和分子生態、農業和動植物檢測等多個研究方向。以下簡要介紹其中幾種。

  1. 腫瘤的早期研究

  循環腫瘤DNA(ctDNA)是活腫瘤細胞釋放的DNA,半衰期約為1.5h。對循環腫瘤DNA進行及時監測分析,不僅有利于早期發現癌癥,還能監測癌癥復發情況,這對癌癥患者的發病率和死亡率產生重大影響。與腫瘤組織活檢相比,血液循環腫瘤DNA分析具有微創性,可以定期隨訪癌癥患者監測癌癥。然而,使用ctDNA進行早期癌癥診斷也并不容易,因為血液中存在的腫瘤DNA的量較少,并且腫瘤DNA會被源自非腫瘤細胞的DNA稀釋。基于液滴的數字PCR等新技術的開發大大提高了檢測稀有序列的靈敏度、特異性和精確度,為癌癥的早期研究和診斷奠定基礎。

  2. 腫瘤治療的伴隨診斷

  常用體液來源(如血液,胸腹水,唾液及尿液等)的待檢標本中的DNA,有正常脫落體細胞和病變脫落細胞兩種來源,前者的量遠大于后者。通過微液滴處理能在每個微液滴中有效減少正常體細胞DNA的干擾,實現腫瘤標記物的有效檢測,如EGFR,ALK,ROS1,KRAS、BRAF等基因的突變檢測、乳腺癌/胃癌的HER2基因擴增檢測等,應用于腫瘤精準醫學的伴隨診斷。

  3.無創產前篩查

  現有的遺傳學產前診斷方法大都需要通過羊膜穿刺、絨毛取樣等侵入性技術從母體子宮內得到胎兒樣本(細胞、排泄物等) 再進行遺傳學分析。經過幾十年的發展與完善,無論是準確度和安全性都已經得到醫學界的公認,但仍存在一定程度的胎兒流產和死胎的可能性。

  基于母體血液分析的無創產前遺傳疾病篩查是如今的研究熱潮。如21號染色體為3倍體的唐氏綜合征、已知父母基因型的胎兒地貧檢測或已知父母基因型的其它核酸病檢測(孟德爾相關遺傳疾病)。由于目前標本來源主要為血液,而待檢測的胎兒DNA受到母體DNA的干擾,因此檢測的準確性受到影響。基于獨特的微滴化數字PCR技術,可作為二代測序法的補充進行無創產前診斷,從而提高準確度及分辨率。因此,數字PCR技術在遺傳學產前檢查中具有廣泛的應用前景。

  4.病原微生物的檢測

  疾病預防控制中心、出入境檢驗檢疫局系統的實驗室,采用數字PCR技術了可滿足該類實驗室對于檢測結果的要求:靈敏度更高、重復性更好、無需依賴標準曲線的絕對定量結果,同時操作簡便。

  對于研究類型的實驗室,可利用dPCR靈敏度高的特點,對各種樣品中的病原微生物進行研究。如HIV抗逆轉錄病毒治療過程中病毒殘留量的監控;HBV耐藥突變的檢測;HCV的分子分型;抗甲氧西林金黃色葡萄球菌的院內感染監控;環境微生物不同功能基因之間的連鎖分析等。

  5. 甲基化含量鑒定

  作為表觀遺傳學研究中重要的一個研究方向——甲基化程度分析,現階段有不同的方法或技術來進行研究:如傳統的亞硫酸氫鹽處理后的克隆測序統計法、抗體檢測法、定量PCR檢測法等。這些方法皆因方法學的問題而不能獲得精確的定量,而微滴式數字PCR系統通過對樣品的微滴化處理及目標因子的絕對拷貝數定量,為甲基化程度的精確定量檢測提供了一種全新的技術。

  6.拷貝數分析

  基因拷貝數變異(Copy number variations,CNVs)是指人類基因組中存在的,較之于參照基因組DNA片段缺失或復制大于1kb到Mb的亞微觀結構變異,CNVs本身蘊含著豐富的遺傳信息,對于研究基因變異在生物進化及疾病進程等領域具有重要意義。相較于現有的CNVs研究技術(定量PCR、高密度寡核苷酸芯片high density oligo nucleotide array,FISH,比較基因組芯片microarray based comparative genomic hybridization,array-CGH,測序等),dPCR在靈敏度和分辨率方面更具優勢,尤其適用于更高拷貝數分析,確定確切的拷貝數,檢測精度超過±10%。

數字PCR技術領跑者

  國際上,ABI(Applied Biosystems)和Bio-Rad是數字PCR儀器領域的兩大巨頭。

  · ABI(Applied Biosystems):ABI的dPCR儀器為QuantStudio 3D,采用芯片式分液技術,操作流程全自動;

  · Bio-Rad:Bio-Rad的dPCR儀器包括QX200和RainDrop,均采用液體式分液技術,操作流程均半自動。在價格上,RainDrop優于QX200和QuantStudio3D。

  另外,基因行業巨頭例如Illumina、Roche(羅氏)、ThermoFisher(賽默飛)、Qiagen(凱杰)等均已布局數字PCR技術領域,極大地推動了該領域的產業化進程。

  國內企業包括泛生子、永諾生物、科維思、諾禾致源、小海龜科技、領航基因、新羿生物、愛普拜、銳訊生物均已進軍數字PCR技術領域。(對于布局數字PCR技術的公司,如有遺漏,歡迎大家在評論區進行補充哦。)

  總而言之,數字PCR技術自問世以來,在遺傳病、病原體、癌基因檢測等分子診斷領域等領域發揮了不可替代的作用。可以預見,它將繼續引領分子診斷熱潮,推動精準醫療的發展


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